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                              1. NBT“深度”丨精準、全面、便宜、不依賴亞硫酸鹽,DNA甲基化測序進入新時代
                                BioArt · 2019/03/11
                                DNA中胞嘧啶修飾從基因調控到生長發育過程都起著至關重要的作用,異常的DNA甲基化和羥甲基化與各種疾病有關,因此確定5mC和5hmC的基因組分布對于臨床應用意義重大

                                本文轉載自“BioArt”。

                                1942年,C.H. Waddington在研究細胞發展命運時, 首次提出了表觀遺傳學的概念【1】。由于技術及生物體本身特點等原因, 目前研究較多的表觀遺傳機制主要集中在DNA甲基化和組蛋白修飾。目前,5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)是哺乳動物基因組中發現的兩種最常見的表觀遺傳標記。細胞通過雙加氧酶家族TET (ten-eleven translocation)蛋白將5mC氧化為5hmC,隨后進一步將5hmC氧化成5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC)。與5mC和5hmC相比,5fC和5caC在哺乳動物基因組中的含量極低。DNA中胞嘧啶修飾從基因調控到生長發育過程都起著至關重要的作用【2】,異常的DNA甲基化和羥甲基化與各種疾病有關,因此確定5mC和5hmC的基因組分布對于臨床應用意義重大【3-4】。


                                目前,DNA甲基化和羥甲基化分析測序行業的黃金標準是亞硫酸氫鹽測序【5-6】及其衍生方法:TET輔助亞硫酸氫鹽測序(TET-assisted bisulfite sequencing, TAB-Seq)【7】和氧化亞硫酸氫鹽測序(oxidative bisulfite sequencing, oxBS) 等【8】。這些方法都采用亞硫酸氫鹽處理將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,同時保持5mC和/或5hmC完整,隨后的PCR擴增將尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶,因而實現在單堿基水平推斷每個胞嘧啶的修飾。然而,亞硫酸氫鹽測序存在兩個主要缺點:1)亞硫酸氫鹽處理條件過于劇烈,DNA可能會降解從而降低PCR 及后續分析技術的靈敏度;2)亞硫酸氫鹽測序將未修飾的胞嘧啶完全轉化為胸腺嘧啶(未修飾的胞嘧啶占人類基因組中總胞嘧啶的約95%),將所有胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶嚴重降低了序列復雜性,導致測序質量差,定位率低,基因組覆蓋不均勻和測序成本增加。

                                為了解決以上問題,近日牛津大學宋春曉課題組等在Nature biotechnology發表題為Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution的文章,開發了一種無需亞硫酸氫鹽的測序方法:TET輔助吡啶硼烷測序(TET-assisted pyridine borane sequencing, TAPS)。利用TET將5mC和5hmC氧化為5caC,隨后吡啶硼烷將5caC還原為二氫尿嘧啶(dihydrouracil, DHU),而后的PCR再將DHU轉化為胸腺嘧啶。實例應用結果表明,與亞硫酸氫鹽測序相比,TAPS可以實現更高的繪圖速率,更均勻的覆蓋率和更低的測序成本,從而實現更高的質量,更全面和更便宜的甲基化組分析。

                                在這項研究中,研究人員將含有11mer 5caC的DNA寡核苷酸作為模型DNA,篩選到了商業上可獲得的環境友好型還原劑吡啶硼烷,確認其將5caC轉化為DHU,同時吡啶硼烷也可通過脫甲酰化/脫氨基作用將5fC轉化為DHU,對未甲基化胞嘧啶、5mC或5hmC都沒有活性。TAPS過程利用TET將5mC和5hmC氧化為5caC,隨后吡啶硼烷將5caC還原為DHU,而后的PCR再將DHU轉化為胸腺嘧啶,因此可以用于5mC和5hmC的堿基水平檢測。

                                此外,研究人員還進一步開發TAPSβ的過程:利用β-葡萄糖基轉移酶標記5hmC使其糖基化,從而僅選擇性測序5mC,然后從TAPS結果中減去TAPSβ來推斷5hmC位點。研究人員還使用過氧化鉀取代TET,將5hmC特異性氧化成5fC,可用于特異性地測序5hmC,研究人員將此方法被命名為:化學輔助吡啶硼烷測序(chemical-assisted pyridine borane sequencing, CAPS)。因此,TAPS和相關方法原則上可以對所有表觀遺傳修飾的胞嘧啶進行測序(如下圖)。


                                圖1硼烷還原DNA寡核苷酸

                                為了檢測TAPS的性能,本文將其應用于小鼠胚胎干細胞(mESCs)基因組DNA的測序。HPLC-MS/MS定量顯示,修飾型胞嘧啶中5mC占98.5%,其余部分由5hmC(1.5%)和痕量的5fC和5caC組成,沒有DHU。在TET氧化后,約96%的修飾型胞嘧啶被氧化為5caC,3%被氧化為5fC。硼烷還原后,超過99%的修飾型胞嘧啶轉化為DHU。這些結果表明,TET氧化和硼烷還原均有效地對基因組DNA起作用。TET氧化和硼烷還原均為溫和反應,與亞硫酸氫鹽處理相比沒有顯著的DNA降解,且DNA在TAPS后仍然是雙鏈的,并且轉化與DNA長度無關。


                                圖2模板DNA和mESC基因組DNA的TAPS

                                隨后研究人員對來自E14 mESCs23的兩個基因組DNA樣品進行了全基因組測序,一個使用TAPS(100 ng DNA),另一個使用標準全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)(200 ng DNA)。結果,mTet1和吡啶硼烷的組合中5mC達到最高的轉化率而未修飾胞嘧啶的轉化率最低(圖3a, b),5hmC的轉化率比5mC低8.2%,非CpG環境的轉化率比CpG環境低11.4%(圖3a),與亞硫酸氫鹽測序相當。表明TAPS在5mC和5hmC存在時都能很好地工作。WGBS數據處理需要特殊軟件(如Bismark25),而TAPS使用名為“asTair”的自定義修改調用工具,當處理模擬的WGBS和TAPS讀數時,TAPS / asTair比WGBS / Bismark快三倍以上(圖3c)。由于WGBS文庫中幾乎所有胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶,極其偏差的核苷酸構成會對Illumina測序產生負面影響,導致WGBS讀數顯示胞嘧啶/鳥嘌呤堿基對的測序質量得分比TAPS顯著降低(圖3d)。而亞硫酸氫鹽處理后DNA會降解,使得WGBS的定位率比TAPS顯著降低(圖3e)。因此,對于相同的測序成本,TAPS的平均測序深度超過WGBS的平均深度。


                                圖3 TAPS測序質量優于WGBS

                                在WGBS相同的測序深度下,TAPS未覆蓋區域較少,并總體上顯示更均勻的覆蓋分布。即使控制WGBS和TAPS之間測序深度的差異,CpG島(CGIs)也可被TAPS更好的覆蓋(圖4a)。在E14基因組所有42,741,339個CpG位點中,使用TAPS時88.3%被覆蓋,而WGBS僅為77.6%(圖4b)。TAPS和WGBS對跨染色體甲基化測序有良好的一致性(圖4c)。在每個核苷酸的堿基上,兩種方法都至少讀數三次并有32,428,076個CpG位點重疊(圖4b)。研究人員將。在WGBS讀取的修飾的CpG位點中(修飾的CpG為修飾水平>10%的CpG),96.2%被TAPS修飾后讀取,表明WGBS和TAPS之間具有良好的一致性(圖4d)。而每個CpG的修飾水平中,WGBS和TAPS也存在良好的相關性(圖4E)。這些結果表明TAPS可直接取代WGBS,且提供了比WGBS更全面的甲基化數據。最后,研究人員證明TAPS只需1 ng的基因組DNA即可完成實驗。


                                圖4 TAPS和WGBS的全基因組甲基化比較

                                綜上,研究人員開發并證明TAPS可用于基因組甲基化測序,可在常規使用中直接替代WGBS,同時降低分析成本并提供高質量和更完整的甲基化組。TAPS與各種下游分析方法兼容(如:焦磷酸測序、限制性消化、MALDI質譜、微陣列和全基因組測序等),并能保留長鏈DNA,因此與SMRT測序和納米孔測序等長鏈測序技術結合,可用于研究某些難以測序的區域,提高其應用價值。

                                值得一提的是,數月前,來自北京大學生科院的伊成器實驗室就在 Journal of the American Chemical Society雜志上發表了題為Bisulfite-Free, Nanoscale Analysis of 5-Hydroxymethylcytosine at Single Base Resolution的論文(https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/jacs.8b08297),首次實現了免亞硫酸氫鹽(bisulfite free)的5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)全基因組單堿基分辨率測定,并且解析了之前開發的系列核酸修飾測序技術的分子機理。


                                該研究基于5hmC的特異性氧化與化學標記,且標記產物在隨后的PCR擴增過程發生C到T轉變的現象,開發了免亞硫酸氫鹽的5hmC全基因組單堿基分辨率測序技術(hmC-CATCH)。除了hmC-CATCH技術外,伊成器課題組與合作者還開發了系列免亞硫酸氫鹽的核酸修飾測序技術(Xia et al., Nature Methods 2015; Zhu et al., Cell Stem Cell 2017),這些測序技術都是基于化合物特異性標記5-醛基胞嘧啶(5fC),生成非天然胞嘧啶堿基(M-fC或I-fC),并且這兩個堿基在隨后的PCR擴增過程實現C到T轉變。

                                針對最新發表在NBT上的這一工作,BioArt采訪了伊成器研究員,他表示:“現有的5-甲基胞嘧啶測序技術依賴于亞硫酸氫鹽處理,帶來嚴重的DNA降解。這一新技術的開發,為5mC的檢測提供了重要工具。該技術將5-甲基胞嘧啶的氧化與5-醛基胞嘧啶的特異性標記結合,極具創新性。這項技術與亞硫酸氫鹽測序方法相比,在測序起始量、測序成本和測序數據質量等方面都顯示出優越性,有望替代亞硫酸氫鹽測序成為DNA甲基化檢測新的“金標準”。”  


                                參考文獻:

                                1. Waddington CH. The epigenotype. 1942. Int J Epidemiol, 2012, 41(1): 10-13.

                                2. Li, E. & Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, a019133 (2014).

                                3. Chan, K. C. et al. Noninvasive detection of cancer-associated genome-wide hypomethylation and copy number aberrations by plasma DNA bisulfite sequencing. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 18761–18768 (2013).

                                4. Song, C. X. et al. 5-Hydroxymethylcytosine signatures in cell-free DNA provide information about tumor types and stages. Cell Res. 27, 1231–1242 (2017).

                                5. Lister, R. et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science 341, 1237905 (2013).

                                6. Raiber, E.-A., Hardisty, R., van Delft, P. & Balasubramanian, S. Mapping and elucidating the function of modified bases in DNA. Nat. Rev. Chem. 1, 0069 (2017).

                                7. Yu, M. et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell 149, 1368–1380 (2012).

                                8. Booth, M. J. et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science 336, 934–937 (2012).


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